Per spiegarvi perchè oggi son felice, devo spiegarvi due cose di cio che faccio in lab...
Tutti voi sapete che se si vuole vedere come è fatto un organo lo si prende, lo si affetta sottile sottile (spesso 5 millesimi di millimetro), lo si colora, si schiaffa sotto il microscopio, et voilà il fantastico mondo delle cellule è davanti ai nostri occhi. Questo ovviamente riducendo ai minimi termini.
A seconda di quello che si vuol vedere si possono usare coloranti diversi.
Ovviamente per fare tutto cio bisogna far si che il pezzo di organo non possa putrefarsi, e allora si
"fissa" cioè appena preso dalla bestia lo si immerge in qualcosa che lo conservi il piu possibile tal quale e lo indurisca.
Di fissativi ce ne sono tanti (formalina, alcool, misture varie) ma non tutti van bene per fare tutto. Si deve sempre prevedere cio che si vuole fare.
Ad esempio se si vuole fare una colorazione che si chiama Azan (la mia preferita) non va bene usar la formalina, molto meglio fissativi alternativi.
Tutto questo vale se si vuole prender il pezzetto di organo, metterlo in un blocco di paraffina, e affettarlo al
microtomo (Christine, di cui ho gia parlato).
Ma i pezzi di organo si possono anche prendere, non fissarli ma congelarli in blocchetti di un apposito gel, e poi affettarli al
criostato (che per la cronaca si chiama Gustavo), che è un microtomo che lavora a -20°C, mantenendo tutto congelato.
In questo caso non si fissa il pezzo di organo ma la fettina gia messa sul vetrino. L'organo non marcisce perchè è congelato.
Ok capito fin qui? Mi seguite? Ci son domande?... bene andiamo avanti...
Se volete vedere le cellule, i nuclei, cioè la
morfologia di un tessuto, ovvero come è fatto, come stan bene in fila le cellulette, vi basta far normali colorazioni.
Ma se volete vedere cose più piccole le colorazioni normali non van bene.
Immaginate di voler vedere una singola proteina sulla superficie di una cellula, non potete colorare tutto, dovete colorare solo
QUELLA proteina.
E cavolo, come si fa?
Qui entra in scena l'
immunoistochimica!
Immuno come immunologia, perchè usa gli anticorpi
Isto come istologia perchè tratta sezioni di tessuti
Chimica perchè sfrutta una reazione chimica
Gli
anticorpi li conoscete tutti, son proprio quelle cosine simpatiche che entrano in azione in ogni caso di infezione e simile.
Il lavoro di un anticorpo è semplice: riconoscere una molecola e attaccarcisi.
Gli anticorpi sono anche molto specifici, riconoscono una molecola ben precisa, quella e non un'altra, e ci si attaccano. Solo a quella molecola!
La molecola che viene riconosciuta si dice
antigene. Puo essere un qualsiasi tipo di molecola, ma se viene riconosciuta da un anticorpo è l'antigene di quell'anticorpo.
Tenete poi presente che anche un anticorpo puo esser riconosciuto da un altro anticorpo.
E infine dovete sapere che a un anticorpo si puo attaccare quel che si vuole, in modo che l'anticorpo attaccandosi al suo antigene si porti dietro la sua "coda" che io gli ho attaccato.
E dato che un anticorpo in se non si vede, la cosa conveniente è attaccargli qualcosa che mi permetta di vederlo.
Ovvio no? ^_^
Allora... torniamo alle mie sezioni di ovaio... io so che le cellule dei follicoli in teoria comunicano tra di loro grazie a delle proteine che formano un vero e proprio canale. Se le cellule di vogliono scambiare qualcosa, questo qualcosa deve passare in quel canale.
Ovviamente se il canale c'è le cellule comunicano, altrimenti.... silenzio stampa ^_^
Io voglio vedere se ci sono questi canali.
Allora prendo la mia sezione, e ci metto un anticorpo che riconosca la proteina del canale.
Lui si appiccica li, se la trova.
Poi prendo un secondo anticorpo, che riconosca il primo e ci si appiccichi.
In teoria potrei anche fermarmi qui, ma così vedrei molto poco perchè gli anticorpi sono piccoli piccoli, e se anche gli attacco qualcosa di colorato, loro son tanto piccoli e radi che non vedrei granchè.
Allora devo far si che dove c'è un anticorpo io possa avere una risposta (un colore) molte volte piu intenso.
Uso quindi un secondo anticorpo che ha attaccata come "coda" una molecola detta
biotina.
Poi metto nella mia provetta un'altra molecola detta
avidina. Si chiama così perchè è letteralmente avida di biotina. Se la trova, ne prende più che può. Ed è tanto avida che una molecola di avidina si attacca a 4 molecole di biotina.
Allora riassumendo, con l'aiuto di una figurina, io ho la mia sezione (grigio chiaro) con le proteine che mi interessano (grigio scuro), appiccicati a queste ci sono gli anticorpi primi (arancio), appiccicati a questi ci sono i secondi anticorpi (nero) con la loro coda di biotina (blu), e attaccata alla biotina c'è l'avidina (marrone).
All'avidina ho attaccato, prima, dell'altra biotina (sempre blu) attaccata a sua volta a un
enzima (verde) che è una molecola che fa una reazione chimica, prende una cosa e la trasforma in un'altra.
Fin qui è tutto invisibile, il giochino del colore viene ora.
Il mio enzima divide l'
acqua ossigenata (H2O2, in rosso) liberando ossigeno (O).
L'Ossigeno ossida un altro composto chimico che si chiama
DAB (viola) e lo fa precipitare, cioè cadere sulla sezione laddove avviene la reazione. E la DAB è marrone, quindi dove lei c'è, diventa marrone!
Capite ora che se vedo marrone vuol dire che si è formata tutta la catena di molecole varie, e quindi che li in quel punto c'è una delle proteine che a me interessano, un antigene, un canale nel mio caso!
Se manca anche solo uno degli anelli della catena, il colore non si forma!
Ok se fin qui ci siete arrivati ora vi posso spiegare perchè oggi ho fatto festa... ma prima intervallo
INTERVALLO INTERVALLO INTERVALLO INTRVALLO INTERVALLO
Ok rieccoci qui... fatta merenda? andati in bagno?
Ok allora ricominciamo!
Come ho gia detto gli anticorpi sono molto schizzinosi, loro riconoscono solo cio per cui sono stati prodotti.
E vi dico di più, se la proteina che devono riconoscere è girata in modo diverso dal normale, loro non la riconoscono! E ovviamente non ci si attaccano.
Fetenti vero?
Tutto cio si ricollega al discorso sui fissativi perchè i fissativi comuni, come la formalina, mantengono bene la morfologia (le cellule sono come e dove devono essere) ma purtroppo, cambiano la forma delle proteine. E quindi non si possono piu attaccare gli anticorpi e tutto il gioco della colorazione non avviene.
Se il pezzo lo congelo e lo taglio al criostato le proteine restano perfette, però si perde un sacco di tempo, e si smadonna un sacco, senza contare che difficilmente la morfologia è bella e significativa.
Quel su cui sto lavorando da novembre è praticamente
la ricerca del fissativo perfetto per evitare di usare il criostato, un fissativo che mantenga bene le proteine e anche la morfologia. Specialmente dei follicoli grandi delle ovaie. Che sono bastardi.
E allora da novembre abbiam provato:
Formalina: uno schifo per la morfologia, esclusa a priori per la marcatura (così si chiama tutto il gioco degli anticorpi) perchè gia si sa che fa schifo
Carnoy: è un miscuglio di cloroformio etanolo e acido acetico. Mantiene bene i follicoli piccoli ma sui grandi fa un casino, delle cellule resano solo i nuclei, che non va bene, però va benino per la marcatura.
B5: è a base di formalina e cloruro di mercurio. E altre cose che la casa produttrice ovviamente non dice. Mantiene la morfologia in un modo fantastico, ma essendo a base di formalina non era un buon candidato per la marcatura.
MetilCarnoy: come il Carnoy ma col metanolo al posto dell'etanolo. mantiene benino la morfologia dei follicoli piccoli, dei grandi la tiene solo se sono sani, se non sono piu che sani li incasina tutti... in teoria va bene per la marcatura.
Immaginate per questi campioni prove su prove su prove... centinaia di sezioni, decine di vetrini...
E di tutti questi fissativi il B5 è il migliore per la morfologia, voi vedere le cellule con
TUTTO il citoplasma, vedete il DNA condensato, vedete cose che altri umani non possono nemmeno immaginare.
E poter fare la marcatura sulle sezioni tratate col B5 sarebbe stato fantastico perchè da la certezza che cio che si vede è davvero dove deve essere. Senza contare la semplicità di tagliare la paraffina piuttosto che il congelato!
Alla fine, tanto ho rotto e tanto ho detto e spinto e fatto, che presa per sfinimento la ProffA mi ha detto che ok, avremmo provato a far la marcatura sul B5, anche se lei gia sapeva non sarebbe venuto nulla, per via della formalina e del mercurio che lo compongono.
Ma che devo dirvi, a me il B5 a istinto diceva bene, e non mi sarei messa l'animo in pace se non lo avessi provato di persona.
Così ieri abbiam fatto partire la marcatura per finirla oggi. E oggi l'abbiamo finita.
Abbiamo seguito lo svilupparsi del colore minuto per minuto al microscopio e al momento la ProffA mi diceva
"te lo avevo detto, col B5 non è venuto nulla!"
Messami il cuore in pace son passata a montare le sezioni e quando ben son state montate le abbiamo riguardate e....
E IL B5 DA REAZIONE!!! E' POSITIVO!!!
FUNZIONAAAA!!!
E non solo non rovina le proteine, ma da anche una reazione molto molto localizzata, in puntini precisi, e non diffusa in macchie sbiadite come da il criostato (che in teoria dovrebbe esser er mejo)
Quindi oggi son felicissima, si puo festeggiare... e non vorrei dire ma...
lo avevo detto io! ^_^